WWW.DOCX.LIB-I.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Интернет материалы
 


Pages:     | 1 | 2 ||

«Приложение N 11 к Приказу Минздрава России от 21 марта 2003 г. N 109 ИНСТРУКЦИЯ ПО УНИФИЦИРОВАННЫМ МЕТОДАМ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ПРИ ВЫЯВЛЕНИИ, ДИАГНОСТИКЕ И ЛЕЧЕНИИ ...»

-- [ Страница 3 ] --

Пиразинамид является препаратом, входящим во все схемы лечения, и обладает бактерицидной активностью в отношении внутриклеточно расположенных микобактерий. Особенностью препарата является его высокая противотуберкулезная активность при сниженных значениях кислотности среды (pH ~= 6,0). В то же время для культивирования микобактерий туберкулеза на плотных яичных средах оптимальным является значение кислотности, близкое к нейтральному.

Эти обстоятельства не позволяют использовать стандартные методики для определения лекарственной устойчивости к пиразинамиду на плотных яичных питательных средах.

Постановка опытов по определению лекарственной устойчивости

Непосредственно перед постановкой опыта по определению лекарственной устойчивости необходимо убедиться в том, что отобранные для исследования культуры микобактерий не загрязнены посторонней микрофлорой. Для этого необходимо:

- провести визуальную (макроскопическую) оценку каждой отобранной культуры, обращая внимание на массивность и характер роста, однородность колоний, отсутствие загрязнения, цвет питательной среды;

- провести микроскопию окрашенного по Ziehl-Neelsen мазка из отобранной культуры с целью определения чистоты культуры и степени ее кислотоустойчивости.

Проверенные и отобранные для постановки опыта культуры микобактерий расставить в штативе в порядке номеров.

При любом методе определения чувствительности микобактерий к противотуберкулезным препаратам каждую серию приготовленной питательной среды с препаратами необходимо проверить, засевая на нее заведомо чувствительную культуру микобактерий туберкулеза. Для контроля можно пользоваться чувствительным штаммом H37Rv или любой другой многократно проверенной культурой микобактерий туберкулеза, чувствительной ко всем испытуемым противотуберкулезным препаратам. Контрольная культура засевается так же, как и испытуемые.

Если среда с препаратами приготовлена правильно, то контрольная культура не должна расти при тех концентрациях препаратов, при которых не растут чувствительные к данному препарату штаммы. Появление роста контрольного штамма в пробирке с препаратом указывает на то, что при приготовлении среды с препаратами допущена ошибка, или на то, что неправильно приготовлена бактериальная суспензия.

При подготовке процедуры исследования необходимо предварительно:

- занести номера отобранных культур в рабочий журнал;

- расставить в штативы наборы питательных сред с препаратами для каждой культуры, контрольную пробирку (со средой без препаратов) и пробирку со средой, содержащей салицилат натрия - 1000 мкг/мл;

- на каждой пробирке со средой написать номер культуры, название препарата и его концентрацию.

Пример:

Надпись на пробирке

N культуры по журналу 203 203 203 203

регистрации

Препарат К NaS Sm Sm

Концентрация 10 25

Пояснения Контроль Натрия Стрептоми-Стрептоми-

салицилатцин 10 цин 25

мкг/мл мкг/мл

Приготовление бактериальной суспензии

Выросшую на плотной питательной среде культуру (обязательно несколько колоний) снимают платиновой лопаточкой и помещают в стерильную фарфоровую ступку или толстостенную стеклянную пробирку. В случае наличия роста на 2 пробирках с разными питательными средами (Левенштейна-Йенсена и Финна-II) для приготовления суспензии культуру снимают с обеих пробирок.





Тщательно растирают пестиком или стеклянной палочкой, постепенно добавляя по каплям стерильный физиологический раствор. Полученную суспензию отбирают пастеровской пипеткой и переносят в стерильную пробирку, диаметр которой соответствует диаметру пробирки с оптическим стандартом мутности. Для осаждения клеточных конгломератов и стеклянных или фарфоровых частиц густую исходную суспензию клеток отстаивают в течение 15 минут и переносят в новую пробирку. После этого суспензию культуры стандартизуют по оптическому стандарту мутности N 5 (500 млн. микробных тел в 1 мл).

Затем разводят в 10 раз стерильным физиологическим раствором.

Для этого следует заранее приготовить ряд пробирок по числу

исследуемых культур микобактерий и подписать на них номера

исследуемых культур. В каждую пробирку налить по 9 мл стерильного

физиологического раствора. После приготовления суспензий всех

взятых в опыт культур микобактерий и каждую из приготовленных

пробирок внести стерильной пипеткой по 1 мл суспензии

микобактерий, соответствующей стандарту N 5. Получают суспензии с

7

содержанием клеток, соответствующим 5 x 10 микробных тел. Посев

на среды с лекарственными препаратами производить из этих

суспензий.

Процедура исследования:

- полученную бактериальную суспензию набрать в мерную пипетку объемом 1,0 или 2,0 мл;

- внести по 0,2 мл суспензии в верхнюю 1/3 косяка во все пробирки с питательной средой, приготовленной для определения устойчивости культуры данного номера, тщательно сверяя номер культуры засеваемой суспензии с номерами, написанными на пробирках. Во избежание ошибок все пробирки, подготовленные для засева одной культуры, следует расставлять в одном ряду штатива;

- каждую засеянную суспензией пробирку закрыть ватно-марлевой или дренированной силиконовой пробкой и поставить в вертикальный штатив с тем, чтобы суспензия равномерно распределялась по поверхности косяка среды к дну пробирки;

- использованную для засева пипетку опустить в емкость с дезинфицирующим раствором;

- по завершении засева всех суспензий засеянные пробирки переместить в горизонтальные штативы - "диваны" и поместить в термостат при температуре 37 °C; при этом поверхность косяка питательной среды должна находиться в горизонтальной плоскости, а наклон штатива должен исключить смачивание пробки материалом засева;

- по истечении 2 - 3 суток инкубации ватно-марлевые пробки заменить резиновыми или недренированными силиконовыми;

- после этого засеянные пробирки перевести в вертикальное положение;

- инкубирование проводить в течение 3 - 4 недель при обязательном еженедельном просмотре.

Оценка результатов

Результат определения лекарственной устойчивости учитывают на 21 день после посева. При скудном росте в контрольной пробирке все пробирки с препаратами оставляют еще на 1 - 2 недели в термостате до получения выраженного роста в контроле, после чего выдают окончательный ответ. Культуру считают чувствительной к данной концентрации препарата, если в пробирке со средой, содержащей препарат, выросло менее 20 колоний при обильном росте в контрольной пробирке. Культура считается устойчивой к той концентрации препарата, которая содержится в данной пробирке, если в пробирке со средой выросло более 20 колоний при обильном росте в контроле.

6.4. Альтернативные методы определения лекарственной

устойчивости микобактерий

Существует несколько методов определения лекарственной устойчивости микобактерий. Практически все они основаны на культивировании микобактерий на плотных (яичные или агаровые) или жидких питательных средах и осуществляются как прямой или непрямой метод определения лекарственной устойчивости (см. выше).

При прямом методе на ряд питательных сред, содержащих и не содержащих определенные концентрации лекарственных препаратов, засевается обработанный гомогенизирующими и обеззараживающими средствами обогащенный при центрифугировании осадок диагностического материала.

При непрямом методе на ряд питательных сред, содержащих и не содержащих определенные концентрации лекарственных препаратов, засевается суспензия чистой культуры микобактерий, выращенной на плотной яичной или агаровой среде. Аналогичным образом может исследоваться культура, выращенная на жидкой питательной среде (7Н9 бульон) и соответствующим образом дозированная.

Как указывалось выше, в международной практике используются преимущественно 4 метода:

- метод пропорций на среде Левенштейна-Йенсена или на среде Миддлбрука 7Н10;

- метод абсолютных концентраций на плотной яичной среде Левенштейна-Йенсена;

- метод коэффициента резистентности;

- радиометрический метод Bactec R 460.

6.4.1. Прямой метод абсолютных концентраций

Наряду с непрямым определением лекарственной устойчивости микобактерий в ряде случаев при наличии у больного массивного бактериовыделения (значительное или умеренное количество микобактерий - см. таблицу 3), выявляемого при микроскопическом исследовании мазка нативного материала или осадка, можно использовать метод прямого определения лекарственной устойчивости. В таких случаях производится прямой посев осадка обработанного детергентами диагностического материала на набор питательных сред с противотуберкулезными препаратами. Параллельно, чтобы не упустить возможность выделения культуры микобактерий, обязательно производится посев материала на стандартные питательные среды. Метод прямого определения лекарственной устойчивости может (в случае положительного результата) значительно ускорить получение ответа о лекарственной устойчивости возбудителя. Однако следует иметь в виду, что при его выполнении (в отличие от непрямого метода) производится недозированный засев микобактерий, что значительно затрудняет интерпретацию результатов.

6.4.2. Метод пропорций

Метод основан на сравнении числа микобактерий выделенной

культуры, выросших в отсутствии препарата и в его присутствии в

критических концентрациях. Для этого приготовленную, как описано

выше, суспензию микобактерий, содержащую 1 мг/мл влажного веса

-4 -6

микобактерий, разводят до концентрации 10 и 10. Оба разведения

суспензии засевают на питательную среду без препарата и на набор

сред с разными препаратами. Если на среде с препаратом вырастают

колонии, составляющие более 1% от числа выросших на среде без

препарата, культура считается устойчивой к данному препарату. Если

количество КОЕ, устойчивых к данному препарату, менее 1%, культура

считается чувствительной.

6.4.3. Метод коэффициента резистентности

Этот метод основан на определении соотношения минимальной ингибирующей концентрации (МИК), определяемой для данного штамма конкретного больного, к МИК лекарственно-чувствительного стандартного штамма H37Rv, испытываемых в одном и том же эксперименте. В данном случае штамм H37Rv используется не для контроля опыта, а для определения возможных вариаций при постановке теста. С этой точки зрения данный метод является наиболее точным из трех вышеперечисленных, однако в силу необходимости использовать большое количество пробирок с питательной средой он является и наиболее дорогим. Последнее обстоятельство резко ограничивает его применение.

Кроме описанных выше классических методов культивирования микобактерий туберкулеза на плотных питательных средах, в настоящее время нашли свое применение следующие системы культуральной диагностики микобактерий и определения лекарственной устойчивости.

Полуавтоматизированная радиометрическая система для выявления

микобактерий в диагностическом материале и определения

лекарственной устойчивости к основным противотуберкулезным

препаратам. Для роста микобактерий в системе используются флаконы

с жидкой питательной средой, которая представляет собой

14

обогащенную бульонную основу, содержащую C - меченый субстрат.

По мере роста микобактерий утилизируют меченый субстрат и выделяют

14

радиоактивный углекислый газ C O2 в пространство над средой во

флаконе. В процессе тестирования газ автоматически забирается из

флакона, уровень радиоактивности измеряется и регистрируется в

виде индекса роста по шкале от 0 до 999. Результат посева

считается положительным, если индекс роста превышает заданный

порог. Ежедневное изменение индекса роста пропорционально степени

роста микобактерий туберкулеза в среде. Наличие роста микобактерий

может быть зафиксировано начиная с 4 - 5 суток от момента посева,

учет результатов производят в течение 6 недель.

Для выделения микобактерий и определения лекарственной устойчивости может быть использована система с индикацией роста по флюоресценции в ультрафиолетовом свете.

Пробирки с индикатором роста содержат модифицированный бульон. В пробирки с питательной средой вносят обогатитель и смесь антибиотиков, подавляющую рост посторонней микрофлоры. Встроенный в силикон дна пробирок флюоресцентный компонент чувствителен к присутствию кислорода, растворенного в бульоне. Высокие начальные концентрации растворенного кислорода гасят эмиссию этого вещества, и регистрируется очень низкий уровень флюоресценции. Позднее активно размножающиеся микобактерии поглощают кислород, что позволяет наблюдать более интенсивную флюоресценцию при использовании ультрафиолетового трансиллюминатора. Рост также может быть зафиксирован по наличию негомогенной замутненности - мелких зерен или хлопьев в культуральной среде. Учет результатов производится в течение 8-ми недель от момента посева. Для определения лекарственной устойчивости требуется от 3-х до 14-ти дней.

ВО ВСЕХ СЛУЧАЯХ ИССЛЕДОВАНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЙ РЕЗУЛЬТАТ АНАЛИЗА ДОЛЖЕН ОБЯЗАТЕЛЬНО ПОДТВЕРЖДАТЬСЯ ПРИ КОНТРОЛЬНОМ МИКРОСКОПИЧЕСКОМ ИССЛЕДОВАНИИ НА НАЛИЧИЕ КИСЛОТОУСТОЙЧИВЫХ БАКТЕРИЙ И ОТСУТСТВИЕ РОСТА ЗАГРЯЗНЯЮЩЕЙ МИКРОФЛОРЫ.

Метод, основанный на технологии колориметрического детектирования продукции CO2 как продукта метаболизма субстратов среды развивающимися в ней микроорганизмами. Он обеспечивает уровень чувствительности, ранее достижимый только с помощью радиометрических методик, при высоком уровне безопасности, сокращении времени анализа и трудозатрат.

Система включает флаконы с питательной средой и реагенты, детекторно-инкубационные модули и компьютерную систему учета. В системе используется питательная среда с добавками факторов роста. Система совмещает 3 функции: выделение микроорганизмов из крови; выделение микобактерий из различного диагностического материала; проверка стерильности.

Последняя разработка, используемая для определения лекарственной чувствительности микобактерий к критическим концентрациям 5 противотуберкулезных препаратов (стрептомицин, изониазид, рифампицин, этамбутол и пиразинамид), основана на сочетании агарового метода пропорций с радиометрическими методами, использующими жидкие питательные среды.

Pages:     | 1 | 2 ||



Похожие работы:

«ПРОГРАММА ВСТУПИТЕЛЬНЫХ ИСПЫТАНИЙ В АСПИРАНТУРУ ФГБУ ДНКЦИБ ФМБА РОССИИ ПО ДИСЦИПЛИНЕ 03.02.03 МИКРОБИОЛОГИЯI. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ Программа вступительного экзамена составлена на основании федеральных государственных требований к структуре основной профессиональной...»

«Спецификация промежуточной аттестации по биологии для 10 класса за 2016-17уч.г. Учитель биологии Николаева Галина Анатольевна-1.Формат итоговой аттестации (согласно Учебному плану МБУ лицея №76 на 2016-17уч.год) тестирование.2.С...»

«СПЕЦИФИКАЦИЯ проверочной работы для промежуточной аттестации по БИОЛОГИИ, 5 класс по теме: "Введение. Разнообразие живых организмов" Назначение проверочной работы Проверочная работа предназначена для пров...»

«Муниципальное бюджетное общеобразовательное учреждение "Капустиноярская СОШ МО "Ахтубинский район" Конспект интегрированного урока биология и английский язык в 6 класс...»

«Состав педагогических работников МКУ "Детский дом № 7 "Дружба" № Ф.И.О. сотрудника Должность Общий/ Пед. стаж Квалифика-ционная категория Образование, специальность,квалификация Курсы повышения квалификации, переподготовки 1 Савинова Татьяна  Александровна  Директор 34/34 соответствие зан...»

«ДЛЯ СТУДЕНТОВ СТОМАТОЛОГИЧЕСКОГО ФАКУЛЬТЕТА ПО КУРСУ ОБЩЕЙ МИКРОБИОЛОГИИ. ЗАНЯТИЕ № 1МЕТОДЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ. МИКРОСКОПИЧЕСКИЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ. МОРФОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ Общая цель занятия. Информировать студентов о...»

«21.05.2017Глас Народа: Сегодня в Костромской области в акватории Костромского разлива Горьковского водохранилища прошел турнир по вылову браконьерских сетей "Чистые водоемы". Участие в экологической акции принял губернатор Костромской области Сергей Ситников. Т...»

«ПРАВИТЕЛЬСТВО КЫРГЫЗСКОЙ РЕСПУБЛИКИПОСТАНОВЛЕНИЕ от 23 сентября 2011 года №583 Об утверждении Руководства по учету инфекционных заболеваний в Кыргызской Республике Во исполнение Закона Кыргызской Республики Об общественном здравоохранении, в целях совершенствования учета инфекционных заболеваний в о...»







 
2017 www.docx.lib-i.ru - «Бесплатная электронная библиотека - интернет материалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.