WWW.DOCX.LIB-I.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - Интернет материалы
 

Pages:     | 1 ||

«Экзаменационные вопросы по основам БТ БТ микроорганизмов. 1 блок. 1-5 Тумашбаева 1. Биотехнология, цели и задачи, история возникновения, основные направления. ...»

-- [ Страница 2 ] --

параметр аналогичен сложным процентам (например, если удельная скорость роста равна 0.1ч–1, – значит увеличение биомассы равно 10 % в час). Если величина постоянна, как это бывает в установившемся режиме культивирования, то интегрирование представленного уравнения дает: lnX = lnX0 + t,

где Х0 – биомасса в начальный период времени t.

График зависимости lnX от времени будет иметь вид прямой линии с наклоном. Удельная скорость роста является одним из основных параметров, характеризующих физиологическое состояние продуцента; ряд других параметров может быть выражен через этот показатель.

40. Составьте примерный перечень контролируемых параметров при выращивании микроорганизмов в биореакторах.

Биореактор — прибор, осуществляющий перемешивание культуральной среды в процессе микробиологического синтеза. Биореакторы (ферментаторы)  составляют основу биотехнологического производства. Назначением всякого биореактора является создание оптимальных условий для жизнедеятельности культивируемых в нём клеток и микроорганизмов, а именно обеспечивать дыхание, подвод питания и отвод метаболитов путём равномерного перемешивания газовой и жидкой составляющих содержимого биореактора. При этом нежелательно подвергать клетки тепловому или механическому воздействию.

Для получения продукции в максимальных количествах активный штамм-продуцент выращивают на оптимальной питательной среде в оптимальных условиях культивирования (посевная доза, температура, рН, окислительно-восстановительный потенциал, аэрация, массообменные характеристики, питательные и ростовые добавки, сроки культивирования). Выращивание проводят в ферментаторах (культиваторах), вместимость которых может варьировать от 2 л до 100—400 м3 в зависимости от потребности в продукте.



Процесс культивирования ведется в асептических условиях, чтобы получить чистые культуры целевых микроорганизмов или культуры клеток.

Основным условием для успешного проведения технологического процесса является выбор или получение высокопродуктивного промышленного штамма-продуцента и поддержание его в активном состоянии.

Вторым важным условием является подбор питательных сред, обеспечивающих максимальное накопление биомассы или целевого продукта; питательные среды должны состоять из дешевого, недефицитного и доступного сырья, поскольку при промышленном культивировании микроорганизмов потребляются огромные их количества. В крупномасштабном производстве для приготовления питательных сред служит обычно сравнительно дешевое сырье (меласса, парафины нефти, дрожжи, уксусная кислота, природный газ).

Все формы и виды ферментационных систем создаются, имея основной целью обеспечение одинаковых условий для всех компонентов содержимого реактора. В ферменторах биокатализаторы суспендированы в жидкой среде, содержащей необходимые субстраты для обеспечения роста организмов и образования нужного целевого продукта. Для создания оптимальной биореакторной системы необходимо

точно придерживаться следующей генеральной линии:

• Биореактор должен быть сконструирован так, чтобы исключить попадание загрязняющих микроорганизмов, а также обеспечить сохранения требуемой микрофлоры.

• Объем культивирумой смеси должен оставаться постоянным, т. е. чтобы не было утечки или испарения содержимого.

• Уровень растворенного кислорода должен поддерживаться выше критических уровней аэрирования культуры аэробных организмов.

• Параметры внешней среды, такие, как температура, рН и т. п., должны постоянно контролироваться.





• Культура при выращивании должна быть хорошо перемешиваемая. К материалам, используемым при конструировании сложных, прецизионно работающих ферменторов, предъявляются определенные требования:

а) все материалы, вступающие в контакт с растворами, подающимися в биореактор, соприкасающиеся с культурой микроорганизма, должны быть устойчивыми к коррозии, чтобы предотвратить загрязнения металлами даже в следовых количествах;

б) материалы должны быть нетоксичным и, чтобы даже при самой малой растворимости они не могли бы ингибировать рост культуры;

в)компоненты и материалы биореактора должны выдерживать повторную стерилизацию паром под давлением;

г) перемешивающая система биореактора и места поступления и выхода материалов и продуктов должны быть легко доступными и достаточно прочными, чтобы не деформироваться или ломаться при механических воздействиях;

д) необходимо обеспечить визуальное наблюдение за средой и культурой, так что материалы, используемые в процессе, по возможности должны быть прозрачными.

41. По какой формуле рассчитывают прирост сырой биомассы каллусной ткани растений? Рассчитайте прирост сырой биомассы каллусной ткани, если известно, что сырой вес каллуса моркови, пассируемого и культивируемого в течение одного месяца составлял 2400 мг, при этом   начальный вес сырой каллусной ткани моркови составлял 200 мг, в последующие 7, 10, 14, 18, 21, 25  дней культивирования  вес каллуса был равен 650 мг, 840 мг, 1050 мг,  1 630 мг, 1960 мг, 2100 мг, соответственно.

Прирост сырой биомассы каллусной ткани рассчитывается по следующей формуле:

Wt-W0W0;

где Wt-конечный вес каллуса

W0- начальный вес каллуса

2100мг-200мг200мг=9,5 мг

Ответ: прирост сырой биомассы каллусной ткани составляет 9,5мг.

42. Использование клеточной культуры для промышленного получения биомассы  и БАВ

В настоящее время культура клеток высших растений является альтернативным способом получения биомассы редких лекарственных растений. По сравнению с использованием обычных растений, применение технологий растительных клеток имеет ряд преимуществ:- возможность получения необходимых количеств качественного продукта с воспроизводимыми характеристиками в стерильных контролируемых условиях;

- независимость от климатических и политических факторов;

- возможность внесения изменений в структуру и биохимию тканей растений для получения новых веществ, не свойственных дикому растению;

- удобство производства и очистки продукта.

Для производства биомассы растений в промышленных масштабах используются биореакторы. В них механическим путем полупроточным методом происходит постоянное перемешивание недифференцированных клеток растений, чтобы они постоянно делились и не образовывали ткани и органы. Клетки постоянно увеличивают свою биомассу и соответственно постоянно синтезируют полезные вещества, которые и используются при производстве препаратов.

Использование биологически активных веществ (БАВ) растительного происхождения часто ограничено доступностью растительных ресурсов и может представлять серьезную угрозу для редких видов лекарственных растений. Культуры клеток высших растений могут служить возобновляемым источником ценных вторичных метаболитов, однако до настоящего времени известны лишь единичные примеры их коммерческого применения. Основными причинами сложившейся ситуации являются недостаточная продуктивность культур клеток по вторичным метаболитам и высокая стоимость выращивания. Используя традиционные методы —селекцию продуктивных штаммов, оптимизацию сред, элиситацию, добавление предшественников синтеза — можно повысить продуктивность культур клеток растений на один-два порядка. Методы метаболической инженерии — суперэкспрессия или выключение генов белков, определяющих синтез целевого продукта — могут существенно изменять биосинтетические способности клеток in vitro. В то же время, многие вторичные соединения не удалось пока получить в культуре клеток, что может быть обусловлено спецификой клеточной культуры — экспериментально созданной популяции соматических клеток — как биологической системы. Для этих случаев может оказаться эффективным использование культур органов растений или трансформированных корней (hairy root). Проводятся работы по получению вторичных метаболитов растений в дрожжах и бактериях, трансформированных растительными генами. Использование методов метаболической инженерии пока не привело к значительным успехам, но с развитием знаний по биохимии и физиологии вторичного метаболизма (регуляции и компартментализации синтеза, механизмов транспорта и запасания метаболитов) эти подходы могут стать весьма эффективными.

43. Рассчитайте,  какое количество (в мл) 5% маточного-раствора  витамина В6 (5% ампула, растворенная в 100 мл бидист.воды) необходимо взять для приготовления 1 л питательной среды Уайта  для культивирования клеток томата, если учесть, что по прописи концентрация витамина составляет 1 мг/л.

1мг\л – 2000 мл

х – 2000 мл

х = 1 мг\л 2000мл2000мл = 1 мг\л

1000 мг – 100 мл

х – 1 мл

х = 1000 мг 1 мл100 мл = 10 мг

100 мл – 10 мг

х – 1 мг

х = 100мл 1мг10мг = 10 мл

Ответ: для приготовления 1 л питательной среды Уайта для культивирования клеток томата необходимо взять 10 мл 5% маточного – раствора витамина В6.

44. Способы культивирования протопластов in vitro (изобразите  в виде схемы).

Протопласт - клетка, лишенная целлюлозной оболочки, окруженная цитоплазматической мембраной, сохраняющая все свойства, присущие растительной клетке. Впервые протопласты в 1892 г. выделил Дж. Клеркер.

Способы культивирования протопластов

Существуют два способа культивирования протопластов: метод жидких капель и метод платирования.

В первом случае суспензия протопластов в виде капель помещается в жидкой среде на пластиковые чашки Петри.Метод обеспечивает хороший обмен газами через воздушную фазу и диффузию в раствор экскретируемых продуктов.Кроме того, легко можно добавить свежий питательный раствор в нужной концентрации.

Однако при культивировании этим способом протопласты агрегируются в центре каждой капли. Накапливаясь, они образуют значительное количество фенольных или других токсических соединений, что препятствует успешному культивированию. Этот метод также не удобен, если надо проследить за судьбой индивидуальной колонии протопластов.

Другой широко распространенный метод — агаровая культура (Nagata Т., Takebel., 1971). В этом случае определенный объем суспензии протопластов в жидкой питательной среде наливают в пластиковые чашки Петри, добавляют равный объем той же самой среды, содержащей 1 % агар-агара. Температура не должна превышать 45°С. Чашки Петри заклеивают парафиллюмом и держат перевернутыми при температуре около 28°С. Протопласты фиксированы в одном положении и физически отдалены один от другого.

Вариацией этого способа является культивирование единичных изолированных протопластов в микрокаплях объемом 1 мкл, предложенное Ю. Глебой в 1978 г.

Во втором случае - суспензию протопластов наливают в пластиковые чашки Петри,добавляют равный объем той же среды с 1% агаром при температуре не выше 45оС. После остывания чашки Петри переворачивают и культивируют при 28оС.В данном случае протопласты фиксированы в одном положении и физически отделены друг от друга.

Это дает возможность наблюдать за развитием интактного протопласта: формированием клеточной стенки, делением, ростом и развитием растения. Вариантом этой техники является использование кормящих протопластов или клеток, подвергнутых воздействию рентгеновского или -излучения, что блокирует их способность к делению. Такие протопласты или клетки смешивают с жизнеспособными протопластами и они поддерживают и стимулируют их рост.

Сразу после удаления раствора фермента начинается образование клеточной стенки. Труднее добиться деления клеток и регенерации растений. Регенерация растений осуществляется либо через эмбриогенез, либо через развитие каллуса с дальнейшей индукцией морфогенеза. Добиваются этого добавлением в среду ауксинов или сочетания ауксинов с цитокининами.

На пролиферацию клеток, возникших из протопластов, влияет 4 фактора:

- видовая специфичность и физиологическое состояние исходной ткани растения,

- способ и условия выделения протопластов,

- плотность высева протопластов,

- состав питательной среды.

45. Технология криосохранения клеток, тканей, органов растений (изобразите схематично этапы технологии).

Криосохранение - замораживание при сверхнизких температурах. Обычно его проводят в жидком азоте, при температуре -196oC.

Работа по криосохранению клеток состоит из следующих этапов:

- подготовка культуры клеток,

- добавление криопротектора,

- программное замораживание,

- хранение в жидком азоте,

- быстрое оттаивание

- удаление криопротектора,

- рекультивирование и регенерация растений.

1)Особое значение имеет специальная подготовка культур, целью которой является обогащение ее клетками меристематического типа. Для суспензионных культур важным моментом подготовки является концентрирование.

Для растительных клеток часто требуется предварительное культивирование в особых условиях. В среду добавляют различные вещества, например:

- 2-6% маннит или сорбит для уменьшения размера вакуолей;

- аминокислоты, в первую очередь пролин, который служит для связывания воды в клетке (концентрация до 1 моля или 11,5%), аспарагин, -аминомасляную кислоту;

- кроме того, применяют искусственное закаливание к холоду, когда снижают температуру культивирования, имитируя естественный осенний процесс подготовки к периоду зимнего покоя (применим только для растений умеренного климата). Клеточные культуры выдерживают несколько суток при температуре +8 - +10oC, а затем при +2 - +5oC в течение 1 - 6 недель.

2)Затем идет добавление криопротекторов.

Криопротекторы - вещества, позволяющие снизить повреждающее действие физико-химических факторов при криоконсервировании. К ним относятся сахароза, декстран, этиленгликоль, поливинилпирролидон, диметилсульфоксид (ДМСО), глицерин. Наиболее часто в качестве криопротекторов используют глицерин и ДМСО. Перед добавлением криопротектора суспензию клеток концентрируют путем центрифугирования, надосадочную жидкость сливают. Криопротекторы вносят в культуру за час до замораживания, что приводит к изменению проницаемости мембраны, изменению точки замерзания и оттаивания.

3) Важно найти оптимальную программу замораживания. Выделяют три типа: медленное постепенное замораживание, быстрое и сверхбыстрое. При медленном постепенном замораживании температура в интервале от 0 – до -40 градусов снижается со скоростью 0,5 – 1 градусов в минуту. При быстром замораживании объект с криопротектором сразу же погружается в жидкий азот.

4) Оттаивание производят погружая ампулы с объектами в теплую баню (40 градусов) либо капая теплой водой на объекты.

5) После оттаивания удаляют криопротектор, это обычно делается на холоде.

46. Рассчитайте какое количество (в мл) 1% сток-растворов  ИУК (индолилуксусной кислоты) и кинетина  необходимо взять для приготовления 2 л питательной среды Гамборга Эвелега (В5) с целью индукции гемморизогенеза в каллусной культуре карто-феля, если учесть, что модификация среды с ИУК 1 мг/л  и 3 мг/л кинетина стимулирует   процесс морфогенеза.

1мг -1000мл

х - 2000мл

х = 2000мл1мг1000мл = 2мг

1000мг-100мл

х -1мл

х = 1000мг1мл100мл = 10мг

10мг – 100мл

2мг – х

х = 100мл2мг10мг = 20мл

Ответ: для приготовления 2л питательной среды В5 с целью индукции гемморизогенеза в каллусной культуре картофеля необходимо взять 20 мл 1% сток-растворов  ИУК и кинетина.

47. Генная инженерия. Современное состояние и перспективы генной инженерии.

Генная инженерия — совокупность приёмов, методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма (клеток), осуществления манипуляций с генами и введения их в другие организмы. Генная инженерия служит для получения желаемых качеств изменяемого организма. Генная инженерия позволяет включать и выключать отдельные гены, контролируя таким образом деятельность организмов, а также — переносить генетические инструкции из одного организма в другой, в том числе – организмы другого вида. Генная инженерия берет свое начало в 1973 году, когда генетики Стэнли Кохен и Герберт Бойер внедрили новый ген в бактерию кишечной палочки (E. coli).

Начиная с 1982 года фирмы США, Японии, Великобритании и других стран производят генно-инженерный инсулин. Клонированные гены человеческого инсулина были введены в бактериальную клетку, где начался синтез гормона, который природные микробные штаммы никогда не синтезировали.

Около 200 новых диагностических препаратов уже введены в медицинскую практику, и более 100 генно-инженерных лекарственных веществ находится на стадии клинического изучения. Среди них лекарства, излечивающие артрозы, сердечно-сосудистые заболевания, некоторые опухолевые процессы и, возможно, даже СПИД.

Практические достижения современной генной инженерии заключаются в следующем:

– Созданы банки генов, или клонотеки, представляющие собой коллекции клонов бактерий. Каждый из этих клонов содержит фрагменты ДНК определенного организма (дрозофилы, человека и других).

– На основе трансформированных штаммов вирусов, бактерий и дрожжей осуществляется промышленное производство инсулина, интерферона, гормональных препаратов. На стадии испытаний находится производство белков, позволяющих сохранить свертываемость крови при гемофилии, и других лекарственных препаратов.

– Созданы трансгенные высшие организмы (многие растения, некоторые рыбы и млекопитающие) в клетках которых успешно функционируют гены совершенно других организмов. Широко известны генетически защищенные генно-модифицированные растения (ГМР), устойчивые к высоких дозам определенных гербицидов, а также Bt-модифицированные растения, устойчивые к вредителям.Одной из основных задач, которая стоит перед генной инженерией, является создание программируемых генотипов. Перспективы развития генной инженерии огромны, так могут предоставить возможность человеческому организму противостоять радиации, обитать длительное время под водой, восстанавливать поврежденные органы и т.д. Генная инженерия направляет свои усилия на исследование различных белков, которые способны наделять отдельный организм определенными характеристиками. Другими словами, при помощи генетики ученные смогут наделять определенный организм (растение, животное, человек) свойствами, которые небыли присущи ему ранее.

48. Методы селекции соматических гибридов (изобразите в виде схемы).

Соматическая гибридизация – является новым способом гибридизации, позволяющая преодолевать ограничения полового процесса и искусственно конструировать новые растения. Выделяют следующие методы:

Генетическая комплементация – это такое взаимодействие генов в гибридной клетке, вследствие которого восстанавливается функция дефектных генов. Генетические комплементации производились на основе сорта Nicotiana tabacum, которая отличается дефектными светочувствительными хлоропластами (хлорофиллдефектные мутатанты). Половые гибриды этого сорта имели нормальные хлоропласты, потому что мутации в их клетках комплементировали. Такой же результат был получен путем слияния гаплоидных протопластов обоих сортов Nicotiana tabacum. Эксперимент состоит из следующих этапов:

Сначала в культуре пыльников были получены гаплоидные растения.

1.Эти гаплоидные растения выращивались при слабом освещении и поэтому они имели зеленый цвет.

2.Затем из этих листьев выделялись протопласты.

3.Протопласты подвергали слиянию и культивировали до образования клеточных колоний.

4.Клеточные колонии пересаживали на среду, индуциирующую стеблевой органогенез, и дальше выращивали при хорошем освещении.

5.В этих условиях имели зеленый цвет и выживали только гибридные растения.

Помимо хлорофиллдефектных мутантов используются ауксотрофные мутанты. Ауксотрофы – это биохимические мутанты клеток,которые вследствие мутации утратили способность расти на обычной питательной среде и требуют добавления какого-либо вещества, синтез которого у них блокирован мутацией. Например О.Шидер выделил гибрид мха печеночника, сливая протопласты мужского штамма, ауксотрофного по глюкозе, с протопластами женского штамма, дефектного по никотиновой кислоте.

Физиологическая комплементация – под этим термином понимают способность гибридных клеток жить и размножаться либо переходить к морфогенезу в условиях культуры, при котором родительские клетки этого делать не в состоянии. Для использования физиологической комплементации Э. Кокинг предложил следующий прием:

- Сначала изучаются условия культуры для роста родительской формы и выявляются те, которые пригодны для роста клеток одного родителя и непригодны для другого.

- Затем суспензию клеток после слияния помещают в различные среды, в каждой из низ соответсвенно погибают клетки одного из родителей, но продолжают расти и развиваться только гибридные.

Механическая селекция, т.е. вручную, по визуальному признаку.

- Для этого прежде всего необходимо выделить признаК, по которому можно было бы идентифицировать гибридные клетки, в смеси родительских клеток.

- Используя микроманипулятор или инвертированный микроскоп отобрать продукт слияния протопластов мезофилла и каллусов.

- При отсутствии природных визуальных маркеров протопласты до слияния окрашивают флуоресцирующими красителями.

- Протопласты подлежащие слиянию, метят красками разных цветов.

49. Практическое применение соматической гибридизации (покажите в виде схемы).

Гибридизация соматических клеток является новой технологией для селекционного процесса. Она позволяет скрещивать формы и виды растений, для которых скрещивание половым путем невозможно, т.е. преодолевать несовместимость при межвидовой гибридизации.

Практический успех соматической гибридизации связан с созданием межвидовых, внутриродовых гибридов Nicotiana, Solara, Datura. Посредством гибридизации соматических клеток были получены ценные формы для селекции картофеля. Так соматические гибриды между культурными и дикими видами картофеля имели хозяйственно ценные признаки, и был вовлечен в селекционные работы. К сожалению, при длительном скрещивании получились формы с преобладанием признаков дикого вида.

Очень ценны для селекции также ассиметрические гибриды, содержащие один полный геном одного родителя и только несколько хромосом другого родителя. Для получения таких гибридов нужна направленная элиминация хромосом одного из родителей после слияния. Это осуществляется радиоактивным облучением протопластов этого родителя с целью дестабилизации хромосом.

Методом соматической гибридизации в практике не выведены пока новые сорта сельскохозяйственных культур. Но принимаются меры и усилия.

50 Применение плазмид бактерий в качестве векторов в генной инженерии растений. Требования, предъявляемые к векторным системам.

Векторы – это специфические в отношении клетки-хозяина и способные к репликации структуры, к-е м. присоед. к себе те или иные гены и переносить их в др.кл. Вектор – нуклеот. полс-ть, способная вкл. в ДНК, не нарушая ее целостности. В. д. отв. след. требованиям: 1. д. автономно реплицироваться, 2. Иметь маркеры, по к-м легко обнаружить трасформированные кл. 3. Введение чужеродного гена не должно нарушать функций вектора 4. Нeбольшие размеры.

Большая ч. векторов получена из плазмид E.coli и др.бактерий. Б. сод. ольшое кол. маленьких кольцевых мол. ДНК, состоящих из неск. тыс. пар оснований и наз. плазмидами. Это автономно реплицирующиеся мол. ДНК (ген.элем.), они не сцеплены с гл.хр.и несут гены уст-ти к антибиотикам тетрациклин и канамицин. Плазмиды легко отделить от хр-й ДНК и получить в чистом виде. Сочетание структурного гена и вектора дает рекомбинантную (гибридную) ДНК. Плазмиду и фрагмент ДНК, сод-й нужный ген, переводят в линейную форму, расщепляя их к-л рестриктазой, обр.

мол-ы со свободными концами, к-е м.б либо одноцепочечными, либо тупыми. Их удлиняют с пом.трансферазы, присоед.к ним А или Т, что приводит к получению желаемой комбинации обеих гетерологичных мол. Липкие концы затем сшиваются ДНК-лигазой, и обр.гибридная ДНК, к-ю м.ввести в бакт.кл. Плазмиды легко проникают в бакт.кл. Внутри они нач.реплицироваться. Чужеродная ДНК транскрибируется и транслириуется, и в кл.нач.синт.белка, кодируемого чужеродным геном, т.е происх.трансформация кл. В кл.E.coli м.осущ.экспрессию любого эукариотического гена. Для отбора бакт.кл, сод-х рекомбинантные мол.ДНК с нужным геном, в среду вводят антибиотик (тетрациклин или канамицин), поскольку плазмиды сод.ген уст-ти к ним. Бакт.кл без плазмиды погибают. Т.о, плазмиды служат векторами для клонирования чужеродных генов. В завис.от задач и целей эксперимента исп.разные плазмиды. Сущ.плазмиды с широким кругом хозяев, но есть, к-е размножаются в кл.двух и даже одного вида. Самым подходящим генным вектором для р-й оказались плазмиды почвенных бактерий Agrobacteria. Основной вклад в изучение этой проблемы внесли И. Шелл, М. Ван Монтегю, У. Нестор, М. Гордон, М. Хилтон. В группе почвенных бактерий Agrobacteria есть несколько видов, к-е м.заражать р-я и вызывать образование корончатых каллов, то есть наростов, - недифииеренцированной опухолевой ткани, растущей в месте заражения. К этим бактериям чувствительны почти все двудольные широколистные р-я, а однодольные – нет. Агентом, вызывающим опухоль, явл.плазмида этой бактерии – Ti-плазмида, конкретно – фрагмент, названный Т-ДНК. Значительный интерес как векторы для р-й представляют Ri-плазмиды Agrobacterium rhizogenes, вызывающей раковую болезнь «бородатый корень». В кл.корешков содержаться опины и нес.копий Т-ДНК. В отл.от корончатых галлов трансформированные кл.корешков «бородатого корня» легко поддаются регенерации.

51. Методы разделения X- и Y-содержащих  сперматозоидов.

Еще в начале 80-х годов ученые начали проводить опыты по раз делению сперматозоидов, содержащих Х-хромосому (женскую) или Y-хромосому (мужскую), для этого использовали различные способы: осаждение, центрифугирование в градиенте, электрофорез, обработку специфическими антителами и т. д. Только ближе к 90-м года ученые установили, что с помощью проточной цитометрии сперматозоиды можно успешно разделять. Испытания показали, что телки голштинской породы, оплодотворенные Х-содержащей фракцией сперматозоидов, дали потомство, в котором было 89% самок. Метод разделения на X- и Y-сперматозоиды основан на различии содержания ДНК в X- и Y-хромосомах: X-содержащие сперматозоиды животных (женские) содержат на 4-5% больше ДНК, и при использовании флуоресцентного красителя и мощного фотоумножителя с помощью проточной скоростной лазерной цитометрии возможно выделять фракции, содержащие до 92% половых клеток с X- или Y-хромосомой. Сексированное семя, полученное по данной технологии, гарантирует получение желаемого пола животного до 90%. Единственным на сегодняшний день способом произвести клинически значимое обогащение спермы X- или Y-содержащими сперматозоидами является метод проточной цитометрии. Однако клиническое применение этого способа малоэффективно или даже опасно, так как при этом ДНК подвергается воздействию химических красителей и ультрафиолетовому облучению. 

52 Методы определения жизнеспособности яйцеклеток, сперматозоидов и эмбрионов.

1. Жизнеспособность сперматозоидов хар-ся долей живых сперматозоидов. Подвижный сперматозоид всегда живой. Неподвижный сперматозоид может быть либо живым, но с нарушенными функциями движения, либо мертвым.

1) «Суправитальное окрашивание эозином» основано на неспособности этого красителя проникать через клеточные мембраны. Т.е., эозин не может проникнуть внутрь живого сперматозоида. Эозин проникает внутрь мертвого сперматозоида (поскольку целостность его наружной мембраны нарушена) и окрашивает его в розовый цвет. Для осущ. окрашивания каплю спермы на предметном стекле смешивают с каплей 0,5 % водного раствора эозина и исследуют препарат с пом. микроскопа. Мертвые сперматозоиды окрашены в розовый цвет.

2) «Гипоосмотический тест». Для осуществления теста 1 каплю спермы добавляют к 10 каплям раствора цитрата натрия и фруктозы, смесь выдерживают 30-120 мин при 37°С, затем исследуют с помощью микроскопа. Живые сперматозоиды набухают, что выражается в искривлении хвостов (образуются петли), мертвые сперматозоиды не меняют свою форму.

2. Существуют методы оценки качества эмбрионов, к-е предполагают использование красителей (флюоресцентные красящие веществ FDA и DAP1. Живые эмбрионы ярко

флюоресцируют после инкубации в FDA, но не флюоресцируют после инкубации

в DAP1. У погибших эмбрионов реакции обратные), выявляющих ферментную активность или специальной метки, определяющей повреждение мембран при дефектных состояниях эмбриональных кл.

Также сущ.метод временного культивирования эмбрионов in vitro для уточнения оценки качества по морфологическим критериям. Работу по оценке эмбриона проводят под стереомикроскопом, учитывая стадию развития эмбриона, соответствие ее хронологическому возрасту, определяют морфологию зародышей и, исходя из этих критериев, оценивают качество зародыша и его пригодность для дальнейшего использования. Затем после морфологической оценки извлеченных эмбрионов их замораживают до температуры -196oC, затем оттаивают и проводят повторную морфологическую оценку их качества. Сущность способа закл. в том, что к жизнеспособным относят те эмбрионы, которые в процессе замораживания и оттаивания не снизили своей оценки. Этот способ позволяет по степени изменения их качества прогнозировать результаты приживляемости после нехирургической трансплантации. Жизнеспособность эмбрионов также можно определить по количеству поглощаемой ими глюкозы, входящей в состав питательной среды, на которой развиваются зародыши.

3. Набор красителей позволяет охарактеризовать морфофункциональное состояние клетки, а именно: жизнеспособность, форму, состояние ядерного материала яйцеклеток.

С помощью флюоресцентного красителя pi — пропидиума йодида — определялась целостность мембран яйцеклеток, так как известно, что он проникает только через поврежденные клеточные мембраны и окрашивает ядерный материал. Жизнеспособные нормальные клетки окрашивались только 6-Cfda в зеленый цвет. Окрашивание в красный цвет АО пронуклеусов с помощью красителя клеток указывало на наличие однонитевых и двунитевых разрывов ДНК. В нормальной яйцеклетке отсутствует свечение пронуклеуса в красной области.

53. Доклинические испытания: эксперименты, проводимые in vitro и на лабораторных животных.

Эксперимент с использованием лабораторных животных и других живых объектов является одним из ведущих методов познания в современной медицине, фармакологии, ветеринарии, биологии. Качество лабораторных животных во многом определяет результат эксперимента. Постоянно возрастают требования к качеству лабораторных животных.

Поэтому важнейшей задачей лабораторного животноводства является организация их производства и содержания, обеспечивающих необходимое качество и стандартность животных. Проведение экспериментов на живых объектах должно обеспечивать эффективное использование животных в научных целях, уменьшение их количества, соблюдение принципов гуманного обращения. Основные этапы включают поисковые или исследовательские методы, которые имеют свои фазы разработки лекарств или программ для контроля за развитием болезней. Этапы разработки можно представить в виде следующей триады: 1)доклиническая стадия для определения безопасности и потенциальной эффективности лекарства; 2) клиническая стадия для установления безопасности и эффективности лекарства для человека; 3) постклиническая стадия, когда лекарство мониторируется на его безопасность и его производство и реализация тщательно контролируются с использованием неклинических исследований. За последнее время наблюдается существенный рост экспериментальных процедур, проводимых на животных. Наиболее часто используются в экспериментальной практике мыши, рыбы, крысы и птицы, также экспериментаторы работают на кроликах, собаках, птицах, рептилиях и земноводных. Что особенно характерно для последнего десятилетия – это рост использования приматов после весьма существенного снижения в предыдущие годы. При правильном подходе опыты in vitro позволяют получить информацию об уровне токсичности и ее клеточных и молекулярных механизмах. Токсикокинетические данные in vitro позволяют оценить потенциальные дозы и характер действия наночастиц для последующего исследования на лабораторных животных. Но только токсикологические эксперименты на животных дают достоверную информацию относительно опасности наноматериалов для человека. Поэтому единственным решением остается использование классического подхода в исследовании наноматериалов, где ключевыми объектами исследования остаются разные виды животных.

Современное состояние науки по использованию альтернативных подходов in vitro не позволяет ответить на вопрос о системном действии наночастиц на организм человека. Главными недостатками экспериментов in vitro являются недостаточная валидация полученных результатов в сравнении с экспериментами на животных и невозможность моделирования сложных биологических процессов, например полного воспалительного ответа.

54. Схематически представить получение химер путем слияния 8-ми-клеточных эмбрионов.

-3429074739555 Микрохирургия эмбриональных клеток (морула, бластоциста) для создания аллофенных Животных. Представьте схематически

56. Представьте схему клонирования мышей.

Схема клонирования по МакГрату и солтеру. Впервые пересадки пробовали МакГрат и Солтер на мышах(1983г). МакГрат и Солтер провели свою серию экспериментов и сообщили, что высокий выход живых мышей они получили, когда в качестве доноров ядер использовали зиготы. Из одной зиготы удаляли 2 пронуклеуса (мужской и жен.) и пересаживали туда муж и жен продукт другой зиготы. при этом они использовали обработку веществами, которые разрушали трубочки веретена деления (цитохолазин, колхицин, или колцемин), вследствие чего теряются хромосомы.

С помощью микропипетки удерживали яйцо в области вегетативного полюса, затем прокалывали пипеткой отверстие, откуда «вытекали» хромосомы. При этом наружную блестящую оболочку хорошо прокалывали, в то время как цитоплазматич. мембрану слегка (лишь несильным нажатием). Между цитоплазм мем-ной и блест. оболочкой находится перивителлиновое пространство или зона pellucidа. Далее втягивали внутрь пипетки содержимое цитоплазмы и пронуклеуса. Пипетку с пронуклеусами погружали в каплю среды содержащую вирус Сендай(вирус,который стимулирует слияние мембран). микропипетку с донорскими пронуклеусамии вирусом Сендай таким же способом вводили в перивителлиновое пространство. Благодаря вирусу Сендай (пир тем-ре 37 градусов) происходит слияние мембран донора и реципиента с объединением цитоплазмы.

схему нарисуйте по выше написан тексту.вот картинки, к-рые помогут

( вот так брали внутрь пипетки содержимое цитоплазмы и пронуклеуса )Схема клонирования мышей по Янагимачи

Авторам удалось усовершенствовать метод Вильмута, они отказались от электрической стимуляции слияния донорской соматической клетки с яйцеклеткой и изобрели микропипетку, с помощью к-рой можно было «безболезненно» извлекать ядро из соматической клетки и трансплантировать его в лишенную ядра яйцеклетку. Они использовали для трансплантации ядра клеток, окружающих ооцит, клеток Сертоли из семенников и клеток, выделенных из мозга. Ядра, выделенные из соматических клеток, инъецировали в энуклеированное яйцо с помощью микропипетки. Яйцо активировали к развитию помещением в специальный раствор. Эмбрионы культивировали до стадии 2–8 клеток и затем трансплантировали в матку приемной матери. Процент «выхода» рожденных мышат (их извлекали с помощью кесарева сечения на 18,5–19-й дни беременности) был низок – в разных сериях экспериментов от 2 до 2,8%. Молекулярные исследования доказали принадлежность ядер рожденных мышат к клеткам донора соматических клеток. Т. о., по крайней мере в некоторых случаях, была доказана способность ядер соматических клеток обеспечивать нормальное развитие млекопитающих

57 Стимуляция суперовуляции у самок млекопитающих. Вымывание яйцеклеток. Представьте основные методологические подходы.

При суперовуляции (СО) (множественная) выходит большее количество яйцеклеток, чем при обычной. СО проводят у одноплодных животных с целью увеличения количества получаемых эмбрионов. Для этого используют фолликулостимулирующие гормоны (простагландины, эстрофан, эструмат, матазин и др.).

Степень СО зависит от дозы СЖК— гормонального препарата, представляющего нормальную стерильную сыворотку кобыл, полученную в период от 40 до 100 дней жеребости. Технология предусматривает применение гормона прогестерона и антисыворотки СЖК.

Прогестерон стимулируется желтым телом и активизирует процессы в матке для сохранения беременности. Антисыворотка СЖК применяется для сокращения действия СЖК, к-е длится около 50-60-дней, что снижает качество получаемых эмбрионов. Овулируют в среднем 10 яйцеклеток. Их оплодотворяемость достигает 80% и более. Возможно применение аналогов простагландина-эстрофана, фоллигона и др. Главный недостаток СЖК — сильная антигенность, возможна резко выраженная аллергическая реакция. Также часто образуются кисты яичников, при обработке СЖК при повторных вымываниях процент оплодотворяемости я-кл снижается почти в два раза.

Гипофизарный фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) получают из гипофизов с/х животных. Основное действие ФСГ— стимуляция множественного роста фолликулов. ФСГ из гипофиза овец содержит примесь лютеинизирующего гормона (ЛГ). Разные формы ЛГ влияют на развитие фолликулов, секрецию эстрогенов, формирование желтого тела, продуцирование им прогестерона.

Гонадотропин - рилизинг гормон образуется в передней доле гипоталамуса, вызывает выделение ФСГ и ЛГ из гипофиза. Хороший эффект достигается при введении ФСГ, выделяемого передней долей гипофиза. Гормон ФСГ в комбинации с ЛГ вводят в соотношении 5:1 многократно. От доноров в течение года можно получать эмбрионы пять раз с интервалами в 45-65 дней при вымывании в среднем по 5-6 эмбрионов за один цикл.

Оплодотворенные яйцеклетки от суперовулированных коров-доноров могут быть извлечены тремя способами: после убоя коровы-донора, хирургическим и нехирургическим.а) Извлечение эмбриона после убоя коровы-донора. Является самым простым и надежным способом. Известно, что яйцеклетки после овуляции и оплодотворения на четвертые сутки переходят из яйцепроводов в рога матки. Следовательно, если зиготы извлекать не позднее, чем трое суток после искусственного осеменения, то достаточно промыть лишь яицепроводы, в которых находятся ранние эмбрионы. Время между убоем донора и вымыванием эмбрионов не должно превышать 30-40 мин., пока не начался процесс кл-го переваривания в половых органах.

б) Извлечение эмбриона хирургическим способом. Для трансплантации рекомендуется использовать бластоцисты, поэтому эмбрионы извлекают между 7-8-ми сутками после первого искусственного осеменения. Имеется несколько способов: разрез верхнего свода влагалища; лапаротомия (вскрытие) по белой линии живота; лапаротомия в области голодной ямки. Способ более трудоемок; необходимы высокая квалификация хирурга, операционный зал и стерильные условия и особенно важно, им нельзя пользоваться многократно.

в) Извлечение эмбрионов нехирургическим способом. Катетерный (нехирургический) способ практически не вызывает каких-либо осложнений в орг.жив-го. Можно успешно извлекать эмбрионы в животноводческом помещении. Эффективность способа высока, повторность многократна. Вымывают эмбрионы на 7-8 сутки после осеменения. Для вымывания используют специальную питательную среду Дюльбекко. Продолжительность манипуляции 20-50 мин.Для получения эмбрионов этим способом разработаны специальные катетеры, система био-ски нейтральных шлангов, сосуды для спец.среды и приема промывной среды с эмбрионами. Промывную среду вводят в рога матки и удаляют из них с помощью шприца. Фракционное (5-6 раз) промывание рогов матки обеспечивает извлечение до 76% эмбрионов.

58 Вазектомия у самцов. Отразите этапы операции.

Вазектомия - иссечение спермиопровода; способ подготовки пробников (быков, баранов, хряков и реже жеребцов), доступный в условиях любого х-ва. Вазэктомированные самцы сохраняют способность к половому акту, но лишены возможности оплодотворения самки, т. к. во время коитуса в половые пути последней выделяют только секреты придаточных желез. Спермии в этом случае попадают в полость общей влагалищной оболочки семенника, где всасываются и оказывают стимулирующее воздействие на организм самца. Вазэктомированные самцы очень активны, являются лучшими пробниками-стимуляторами. Существует неск. способов В. самцов.

Способ Краснитского. Быка фиксируют в правом боковом положении; подготавливают операционное поле. Вводят под кожу по линии намечаемого разреза 5,0—7,0мл 1%-ного р-ра новокаина с адреналином. В области каудальной поверхности шейки мошонки, параллельно шву мошонки, отступя от него на 0,5—1 см, разрезают кожу на длину не более 4 см, затем рассекают мускульно-эластич. оболочку, фасцию, волокна мускула поднимателя семенника и общую влагалищную оболочку. Чтобы не вызвать ранения большого кол-ва сосудов семенного канатика, общую влагалищную оболочку рассекают осторожно. Спермиопровод захватывают анатомич. пинцетом и после отпрепаровки от сосудов иссекают его ножницами. На рану (кроме общей влагалищной оболочки) накладывают 4—5 стежков узловатого шва. Швы в течение 8—10 сут прикрывают слоем стерильной ихтиоловой мази.

Способ Шипилова. Разрезы делают на краниальной поверхности шейки мошонки, где волокна мускула наружного поднимателя семенника не проходят и легче обнаружить спермиопровод. После рассечения общей влагалищной оболочки в рану вводят указательный палец и захватывают им семенной канатик вместе со спермиопроводом. Освободив спермиопровод от брыжейки, его иссекают. В. молодых самцов можно делать через один разрез.

Способ Андреевского. Рассекают все слои мошонки и общей влагалищной оболочки в области верхушки мошонки, извлекают хвост придатка и иссекают его вместе с начальной частью спермиопровода.

Вазектомия самцов мыши. Наиболее удобный возраст для операции 6 недель, пока она не начали жиреть. Вазэктомия заключается в вырезании короткого фрагмента семявыводящего протока. операцию делают посредством единого поперечного брюшного разреза. Предварительно самца нужно наркотизировать авертином. Семявыносящий проток можно найти, не извлекая семенников, - для этого достаточно оттянуть жировую подушку. Недостаточно просто перерезать протоки, нужно перевязать их концы. После того как будет найден проток, нужно положить пинцет со сведенными браншами на длинный конец лигатуры, накинуть лигатуру сверху на бранши ножниц для образования петли. Слегка развести бранши, захватить ими короткий конец лигатуры, протащить через петлю и затянуть узел. Далее нужно наложить два шва на брюшину и три шва на кожу. Через несколько дней к самцу подсаживают самку для проверки успешности операции (иногда протоки срастаются). Если в течение трех недель самка не забеременела, самца можно использовать для получения ложнобеременных самок.

59 Представьте схему получения химер

242570186055

60. Схематически отобразите основные подходы к клонированию генов:  клонирование методом «дробовика» и «прогулка по хромосоме» и создание к-ДНК-овых библиотек

Можно создавать два типа библиотек ДНК: геномную и клоновую (кДНК).

Геномная библиотека. Если геном какого-либо организма разрезать, вставить в плазмидные или вирусные вектора и ввести в клетку, то в таком виде его можно сохранить.

При разрезании плазмидной или фаговой ДНК вероятность выпадения целых и неизмененных кусков генома довольно высока. Такой способ получения геномной библиотеки получил название «метод дробовика», так как геном в данном случае представлен отдельными фрагментами. Получают рекомбинантную плазмидную ДНК. Плазмиды одной колонии содержат клон геномной ДНК, а совокупность плазмид можно назвать библиотекой геномной ДНК. Недостаток такого метода в том, что фрагменты ДНК образуются в огромном количестве, лишь часть фрагментов содержат полноценные гены. Библиотека кДНК. Создание кДНК начинается с синтеза на матрице РНК с помощью обратной транскриптазы комплементарной нити ДНК. Затем создают щелочные условия, разрушают цепь РНК на нуклеотиды, после чего с помощью ДНК-полимеразы синтезируют комплементарную цепь ДНК. При этом образуется фрагмент ДНК с тупыми концами. При амплификации плазмиды образуется клон комплементарной копии ДНК (кДНК). Преимущества клоновой ДНК перед клонами геномной ДНК в том, что кодирующая белок нуклеотидная последовательность гена ничем не прерывается. Для примера, допустим, что имеются два случайных фрагмента, полученных методом дробовика:

Цепь Последовательность

Первоначальная AGCATGCTGCAGTCATGCTTAGGCTA

Первый фрагмент AGCATGCTGCAGTCATGCT--------------------------TAGGCTA

Второй фрагмент AGCATG--------------------------CTGCAGTCATGCTTAGGCTA

Восстановленная последовательность AGCATGCTGCAGTCATGCTTAGGCTA

«Прогулка по хромосоме» заключается в последовательном отборе клонов, несущих перекрывающиеся в концевых участках фрагменты ДНК из определенной области генома. Выделив клоны путем скрининга библиотеки с помощью маркерной ДНК, сцепленной с нужным геном, их используют в качестве ДНК-зондов для поиска других клонов с перекрывающимися последовательностями. В результате получают набор фрагментов, полностью перекрывающих область поиска гена. Строят физическую карту данной области.

Pages:     | 1 ||
Похожие работы:

«СПРАВКА рабочей группы №3 по подготовке вопроса к очередной сессии "О реализации решения XL сессии областного маслихата от 3 ноября 2011 года №450 "Об экологической обстановке в Караганд...»

«Протолитический баланс почв Е.В. Шамрикова, д.б.н., Институт биологии Коми НЦ УрО РАН Протолитический баланс (ПБ) почв в значительной мере является продуктом почвообразования и представляют собой фундаментальную характеристику, контролирующую подвижность химических элементов, в том числе многих элементов питания и поллютантов, в п...»

«бюджетное учреждение высшего образования "Сургутский государственный педагогический университет", научно-исследовательская лаборатория "Биологические основы безопасности образовательного пространства" г. Сургут, Ханты-Мансийский автономный округ – Югра ПроектДЕТИ ЮГРЫ ЗА СОХРАНЕНИЕ ЖИЗН...»

«Аннотация рабочей программы дисциплины Б1.Б.8 Анатомия человекаНаправление 34.03.01 Сестринское дело Б1.Б Базовая часть Место дисциплины в учебном плане: цикл, в каких семестрах изучается, количество з.е.; количество часов всего/аудиторных: лекционные, практические;...»

«Дорогие коллеги! Приглашаем вас на семинар Биологическое образование и его роль в повседневной жизни. Как школьные уроки могут спасти исчезающие виды животных от вымирания? 22 сентября 2016 г. в 17:00, в Государственном биологическом музее им. К. А. Тимирязева (Москва, Малая Грузинская, 15) Семинар проводит София Шухова — популяризатор движе...»

«Муниципальное бюджетное общеобразовательное учреждение, средняя общеобразовательная школа № 11 н.п.Зареченск "Рассмотрена" "Утверждаю" на заседании педагогического совета Директор школы: Денисова Л.А прот...»

«В монографии обобщены литературные данные и результаты собственных научных исследований авторов по химии, биологии и медицинскому применению гиалуроновой кислоты. Приводятся данные о новом классе физиологически активных соединений гиалрипайерах – комплексах гиалуроновой кислоты с ключевыми метаболитами...»

«Использование биологически активных добавок к пище для коррекции рациона питания детей Л.Ю. Волкова, канд. мед. наук, гл. специалист медицинского управления ООО ЛЕОВИТ нутрио Полноценное и регулярное поступление в детский организм всех необходимых микронутриентов витаминов, м...»

«Аннотация рабочей программы дисциплины С2.Б.6. Анатомия человека, топографическая анатомия Специальность 32.05.01 Медико-профилактическое дело С.2 Математический, естественнонаучный и медико-биологический цикл Базовая часть...»

«Гендер — социальный конструкт или биологический императив? Бабетт Франсиз Споры о том, биология или среда определяют выбор человеком тех или иных поведенческих ролей и образа жизни, характерны для социобиологии. Начиная с 1970-х годов, завязалась общая диск...»

«Специальность 060105.65 "Стоматология" Аннотация рабочей программы учебной дисциплины ЕН.Ф.07 "Анатомия человека. Анатомия головы и шеи" Целью изучения дисциплины является прио...»

«Урок 11Те ма: ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О КЛЕТКАХ. КЛЕТОЧНАЯ МЕМБРАНА Задачи: дать учащимся общие сведения о клетках, рассмотреть строение клеточной мембраны и ее значение в жизни клетки; познакомить с явлениями пиноцитоза и фагоцитоза. Элементы содержания: цитоплазма, ядро, органоиды, мембрана, фагоцитоз, пи...»








 
2017 www.docx.lib-i.ru - «Бесплатная электронная библиотека - интернет материалы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.